光声双模态纳米探针在肝成像中的应用

肝纤维化、肝硬化以及肝癌是严重危害人类健康的肝脏疾病。影像学检测是发现病灶的主要手段之一，如能够早期发现肝脏病变并对肝脏功能状态进行评价，对指导治疗和评价预后意义重大。去唾液酸糖蛋白（asialoglycoprotein，ASGP）受体主要位于哺乳动物的肝脏实质细胞膜表面，少部分位于细胞膜内侧，可参与肝脏的血清蛋白代谢。发生肝癌、肝硬化、肝纤维化等肝脏疾病时，ASGP受体的数量及活性下降，肝功能降低[1-5]。因此，检测ASGP受体有助于判断肝脏功能。随着各种显像手段的发展，越来越多的探针针对ASGP受体这一位点进行设计制备。随着医学影像的飞速发展，将具有不同功能的成像模式结合起来，为病情诊断提供更多元、更丰富的互补信息，成为这一领域的研究热点[6-8]。本研究拟将单光子发射型计算机断层扫描（SPECT）成像与光声成像相结合，合成ASGP受体靶向的纳米颗粒131I-LBI-NPs用于SPECT/光声双模态成像，以期作为一种肝脏疾病的显像探针，丰富疾病的检测手段。

1 材料与方法

1.1 主要材料及动物 VFD1000型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；γ-计数仪（西安核仪器厂）；小动物SPECT成像仪（匈牙利Mediso公司）；小动物光声成像仪（美国Endra Life Sciences）。Na131I来自福建省泉州市第一医院；牛血清白蛋白、吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）、氯胺-T购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。KM小鼠4周龄，雌性，体重16～18 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2 LBI-NPs的制备及131I标记 半乳糖修饰的牛血清白蛋白（LB）的合成：将500 mg乳糖酸溶解于去离子水中，待其全部溶解后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐534 mg及N-羟基琥珀酰亚胺321 mg。在室温下反应2 h后加入1 g牛血清白蛋白，待其全部溶解后用1 mol/L NaOH溶液调节pH值为9，继续反应3 d。反应完成后，将反应液移至透析袋（截留相对分子质量7×103）中，使用去离子水透析3 d。收集透析后的溶液并进行冷冻干燥，得到淡黄色固体即为乳糖酸修饰的LB。

131I标记的LB溶液的制备：采用氯胺-T法对LB进行131I标记。将10 mg LB溶解于1 ml PBS（pH值为7.8），加入Na131I溶液3 mCi，混合后，加入新配置的氯胺-T 50 μg/20 μl。迅速振荡混匀，室温下反应5 min。然后加入还原剂偏重亚硫酸钠100 μg/40 μl，以终止碘化反应，即得到131I标记的LB溶液。

131I标记的LBI-NPs的制备：取131I标记的LB溶液，搅拌并加入5 mg还原型谷胱甘肽，反应30 min后缓慢加入5 mg ICG，继续反应1 h。然后加入1.1 ml无水乙醇，继续搅拌30 min。反应完成后将反应液移至透析袋中，在偏碱性溶液中4℃条件下透析过夜。透析完成后收集透析袋中的溶液，即得到131I-LBI-NPs分散液。以聚酰胺薄膜/生理盐水为层析体系，可以测定标记率。

1.3 131I-LBI-NPs标记率的鉴定 用毛细管吸取131I-LBINPs分散液在聚酰胺薄膜底端点样，自然吹干。然后用生理盐水展开。131I-LBI-NPs的Rf值为0～0.1，游离的131I-的Rf值为0.4～0.5。层析结束后将纸条剪成10段，用γ放射性计数仪检测计数，计算标记率。

1.4 131I-LBI-NPs的光谱及粒径测定 由于131I具有放射性，在此以稳定的127I代替131I进行光谱和粒径的测试。取少量127I-LBI-NPs，用酶标仪测定其吸收光谱。此外，取少量127I-LBI-NPs，利用粒度仪及电镜测定其粒径及纳米颗粒形貌。

1.5 131I-LBI-NPs在小鼠体内的分布 将20只KM小鼠随机分为5组，每组4只，每只小鼠尾静脉注射10 μCi 131I-LBI-NPs，注射后分别于5、30、60、240 min将小鼠断头处死，取心脏、肝、肺、肾、脾、胃、骨、肉、肠、血称重，随后测定各个器官的放射性计数，并计算单位每克组织摄取放射性占注入量的百分率（%ID/g）；抑制组提前5 min注射1 mg LB进行抑制。

1.6 小鼠SPECT成像实验 另取3只正常小鼠进行SPECT成像。在注射放射性标记物前10 min注射NaI溶液对小鼠甲状腺进行封闭。通过尾静脉注射131I-LBI-NPs 100 μCi，小鼠显像过程中进行异氟烷麻醉并固定在显像仓中，每只小鼠跟踪扫描5 min、30 min、60 min的成像。采用低能高分辨准直器、断层采集，矩阵为256×256，旋转360°，每15°采集一帧，每帧采集30 s。

1.7 小鼠光声成像实验 另取3只正常小鼠进行光声成像实验。进行成像前将小鼠胸腔前的毛发去除洗净，以避免其对光声成像的干扰。通过尾静脉注射200 μl 131I-LBI-NPs的透析液，并将小鼠用异氟烷进行麻醉。进行图像扫描时将小鼠的胸腔紧贴托盘底部，使肝脏部位对准托盘中心位置，此项操作可排除其他器官的信号干扰。每只小鼠采集注射前以及注射后5 min、30 min、60 min的成像。

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